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ISKNV感染导致CPB细胞葡萄糖代谢重构及其在病毒增殖中作用研究
编辑: admin 来源: 未知 时间: 2020/7/3 23:57:38

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【摘要】:传染性脾肾坏死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)属虹彩病毒科、肿大细胞病毒属,是一种二十面体具囊膜的双链DNA病毒。

该病毒每年给我国鳜养殖业造成数亿元的经济损失。 开展ISKNV与宿主细胞互作研究,可为传染性脾肾坏死病(Infectiousspleenandkidneynecrosis,ISKN)防控提供新的思路。 病毒作为一种非细胞结构生物,依靠宿主细胞代谢完成自身生命周期,因此病毒诱导细胞代谢重构是病毒与细胞互作最主要的表现形式之一。

而葡萄糖作为细胞供能和大分子物质合成重要碳源,在细胞代谢重构中的作用尤为关键。

因此,本论文针对ISKNV感染如何影响宿主细胞糖代谢这一科学问题,以鳜脑细胞系(Chineseperchbraincell,CPB)为模型,探究ISKNV感染导致CPB细胞葡萄糖代谢重构以及磷酸戊糖途径、糖酵解途径和TCA循环在病毒复制中的作用,为阐明ISKNV致病机制提供新的思路,取得的主要结果如下:1、ISKNV感染导致细胞葡糖糖代谢重构蛋白组研究发现ISKNV感染早期CPB细胞6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PDH)、丙酮酸脱氢酶磷酸酶(pyruvatedehydrogenasephosphatase,PDP)和延胡索酸水合酶(fumaratehydratase,FH)表达上调,丙酮酸脱氢酶激酶2(pyruvatedehydrogenasekinase,PDK2)和烯醇化酶1(enolase,ENO1)表达下调,提示ISKNV感染导致了细胞葡萄糖代谢改变。

进一步采用荧光定量PCR发现ISKNV复制阶段可促进己糖激酶1(Hexokinase1,HK1)、G6PDH、磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucoseisomerase,GPI)、ENO1、丙酮酸激酶(Pyruratekinase,PK)和乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)转录上调;蛋白免疫印迹方法发现G6PDH、GPI、LDH和丙酮酸脱氢酶复合物(PDHx)蛋白表达上调;最后通过监测ISKNV一个增殖周期内宿主消耗葡萄糖和产乳酸情况,发现ISKNV感染可促进CPB细胞摄取葡萄糖并产生乳酸,细胞糖酵解增强。 综上说明ISKNV感染导致CPB细胞糖酵解途径、磷酸戊糖途径增强,并促进丙酮酸进入TCA循环。

2、磷酸戊糖途径在ISKNV增殖中的作用在发现ISKNV感染上调细胞G6PDH表达的基础上,利用DHEA抑制G6PDH,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹方法测定G6PDH转录和蛋白表达水平,发现G6PDH转录和蛋白表达水平均下调,说明G6PDH被抑制;测定上清中葡萄糖和乳酸情况,发现乳酸产率明显下降,说明糖酵解减弱;通过荧光定量PCR方法测定ISKNV基因组拷贝数,发现添加DHEA导致48hpi上清病毒基因组拷贝数仅为对照组的45%,当向上清中回补dNTP后,病毒基因组拷贝数回复到对照组的113%。

综上说明:ISKNV通过上调G6PDH以促进葡萄糖代谢进入磷酸戊糖途径,产生的戊糖为ISKNV基因组复制提供原料。

3、糖酵解途径在ISKNV增殖中的作用在发现ISKNV感染促进细胞糖酵解的基础上,利用2-DG抑制CPB细胞糖酵解,测定病毒感染后上清中葡萄糖和乳酸浓度,发现在0-48hpi葡萄糖消耗率和乳酸积累速率相比对照组显著降低,说明糖酵解被抑制;通过荧光定量PCR方法测定细胞内和上清中ISKNV基因组拷贝数,发现2-DG抑制ISKNV增殖,而当向上清中回补丙酮酸,48hpi上清中病毒基因组拷贝数回复到对照组的67%。 综上说明:糖酵解为ISKNV增殖所需,在病毒增殖过程中提供丙酮酸。 4、TCA循环在ISKNV增殖中的作用在发现ISKNV感染抑制PDK2继而增强丙酮酸脱氢酶复合物活性,促进丙酮酸进入TCA循环的基础上,利用DCA抑制PDK,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹方法测定PDK2转录水平和PDHx蛋白表达水平,发现PDK2转录被抑制,PDHx蛋白表达增强;测定上清中葡萄糖和乳酸情况发现葡萄糖消耗速率升高而乳酸产率下降,说明丙酮酸可能进入TCA循环;通过荧光定量PCR方法测定ISKNV基因组拷贝数情况发现其增殖被抑制。

综上说明:TCA循环可能是ISKNV依靠宿主实现自身增殖的辅助途径。 【学位授予单位】:上海海洋大学【学位级别】:硕士【学位授予年份】:2018【分类号】:。

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